近期，复旦大学与罗氏中国创新中心等团队联合在药物化学领域权威期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表题为"Design and Synthesis of Novel, Non-ATP-Competitive MKK3 Modulators as Suppressors of TNF-α Production for the Treatment of Ulcerative Colitis"的研究论文。

该研究发现了基于茚酮母核的全新非 ATP-竞争性-MKK3-别构调节剂(R)-48。该候选分子可通过阻断TAK1介导的MKK3激活，抑制TNF‑α等关键促炎因子生成，在溃疡性结肠炎临床前动物模型中展现出优异的口服治疗效果。该研究中溃疡性结肠炎模型的体内药效评价实验，由澎立生物（PharmaLegacy Laboratories）参与完成。

研究背景：从p38 MAPK到上游调节因子MKK3

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）是一类易复发的慢性炎症性肠病。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是UC治疗中已得到临床验证的关键靶点，但目前靶向TNF-α的治疗主要是可注射生物制剂，口服小分子药物的研发与应用尚未满足临床需求。

鉴于p38 MAPK信号通路参与炎症反应过程，研究人员曾通过抑制p38 MAPK来减少TNF-α等促炎介质的产生。但多种ATP竞争性p38抑制剂在临床试验中均未取得理想结果，如SB-242235（I期试验终止）、Losmapimod（III期试验失败）、Doramapimod（II期试验终止）。其失败的核心原因为ATP竞争性抑制剂作用于激酶的ATP结合口袋，而人类激酶组中该结构高度保守，难以实现高度的靶点选择性，极易诱发明显的脱靶效应及剂量限制性毒性。

基于上述研究背景，研究团队将研究重点转向p38上游的调节因子MKK3。MKK3是TAK1/MKK3/p38信号通路的重要组成部分，可通过磷酸化激活p38。团队此前发现的先导化合物(R)-STU104对MKK3具有较高结合亲和力（KD=71nM），但其对MKK3的直接催化抑制作用几乎可以忽略不计（25 μM时抑制率<10%）。这一结果提示，该化合物可能并非直接竞争抑制ATP结合位点发挥作用，而可能通过其他机制影响MKK3的激活过程。

核心发现：从先导化合物到候选分子(R)-48

研究团队以先导化合物(R)-STU104为基础，对茚酮骨架的A、B、C三个结构区域进行多轮药物化学修饰，并对设计并合成的多种新型化合物进行生物学评估，最终获得化合物(R)-48，进一步探究其作用机制、体外活性及成药相关性质。

本研究通过氢‑氘交换质谱（HDX‑MS）实验证实，(R)-48结合于MKK3蛋白C叶远端别构口袋，不作用于ATP结合口袋。该分子不直接抑制MKK3本身的催化酶活性，而是通过空间位阻以及诱导蛋白构象改变，阻止上游TAK1激酶对MKK3的磷酸化的激活，进而阻断下游p38介导的炎症信号级联反应。该研究对81种人源激酶开展广谱激酶组筛选，在10 μM测试浓度下，未观察到显著脱靶抑制效应，规避了传统ATP竞争性激酶抑制剂选择性差的短板。

在LPS刺激RAW264.7巨噬细胞模型中，(R)-48抑制TNF‑α生成的IC₅₀达到0.038 μM；SPR表面等离子共振测得分子与MKK3结合亲和力KD=3.35 nM，相较于先导物(R)-STU104亲和力提升20倍以上。此外(R)-48的小鼠体内口服生物利用度F=62.6%，人、小鼠肝微粒体中代谢稳定性优异，无明显hERG通道抑制、无显著CYP450酶抑制作用，体外细胞的CCK‑8实验也未见细胞毒性，证实其生物安全性，具备推进临床前开发的潜力。

图1. (±)-STU104骨架的优化策略（图源：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c01880）

体内药效研究

为系统评价(R)-48的体内抗结肠炎活性，研究团队采用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导和三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的两种啮齿类结肠炎模型进行药效研究，并开展药代动力学/药效学（PK-PD）相关分析。该部分药效实验由澎立生物（PharmaLegacy Laboratories）参与完成，相关动物实验程序经澎立生物动物伦理委员会审批。

1、DSS诱导的小鼠结肠炎模型（口服给药9天）

(R)-48 设置 1、3 和 10 mg/kg 三个给药剂量组，并以美沙拉嗪（50 mg/kg）及先导化合物(R)-STU104（10 mg/kg）给药组作为对照。研究发现，(R)-48呈剂量相关性地改善小鼠体重下降和疾病活动指数（DAI），并减轻结肠缩短症状。在该实验条件下，3 mg/kg (R)-48组的部分药效指标优于50 mg/kg美沙拉嗪组；结肠H&E染色结果显示，(R)-48处理后炎症细胞浸润及组织损伤有所减轻，10 mg/kg组的病理损伤改善率为64.6%；(R)-48处理后血清及结肠组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23水平下降，相关蛋白及mRNA指标亦呈现降低趋势；PK-PD分析在给药后4 h采血测定血浆药物浓度，当体内游离药物浓度高于体外IC₅₀（16 ng/mL），即出现显著治疗效果，为后续给药剂量设计提供依据；生物安全性测试显示高剂量组肝肾组织病理未见明显毒性损伤。

图2. (R)-48对DSS诱导的小鼠实验性结肠炎表型的影响（图源：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c01880）

图3. (R)-48对DSS诱导的小鼠结肠炎相关炎症反应的影响（图源：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c01880）

2、TNBS诱导结肠炎模型（给药5天）

研究团队进一步在TNBS诱导的小鼠结肠炎模型中评价(R)-48药效作用。结果显示，(R)-48给药后小鼠体重及DAI评分得到改善，结肠溃疡面积、组织病理损伤和促炎因子水平均有所下降，且3 mg/kg组在部分药效指标上的表现优于较高剂量的美沙拉嗪对照组。

两种模型中的观察结果为(R)-48抗结肠炎活性提供了进一步支持。

图4. (R)-48对TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎表型的影响（图源：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c01880）

澎立生物自免炎症药效评价平台

本研究中溃疡性结肠炎模型体内药效评价部分，由澎立生物自免炎症平台参与完成。澎立生物作为国内深耕自免炎症临床前CRO，拥有450多种经过充分验证的自免与炎症动物模型，覆盖结肠炎、类风湿关节炎、银屑病、多发性硬化、干燥综合征等主流自免炎症病。平台可构建多种IBD动物模型体系，包括DSS、TNBS、恶唑酮诱导结肠炎等多种小鼠、大鼠炎症性肠病模型，能够实现急性、慢性、复发型肠炎的稳定造模。同时具有完整药效学评价体系，包括动物基本体征、DAI评分、结肠大体形态评估、H&E染色及组织病理学评分；可进行血清/组织多重炎症因子的ELISA、qPCR检测，通路蛋白的WB分析，药物在血浆和组织中水平检测，支持完整的PK‑PD关联研究。另外可进一步开展免疫细胞亚群分析、生物标志物筛选，为候选药物作用机制的深度阐释提供实验依据。该平台所有实验经AAALAC认证，实验数据可追溯，支持国内、海外双申报的IND项目，为众多创新药企与高校课题组的自免炎症新药临床前开发提供技术支持。

如果您正在开发IBD、自免炎症靶点小分子或大分子，需要临床前体内外药效评价，欢迎联系澎立生物咨询方案。

原文全文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c01880

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